ALLGEMEINE TESTANLEITUNG (Kurzfassung)

DIACHECK Anti IgG, -M, -A, -M/A

Indirekter Enzymimmunoassay für den Nachweis von humanen Antikörpern gegen Infektionserreger    

In vitro Verwendung

 

 

Dr. Julio Moran, Laboratorien, Lohwisstrasse 32, CH-8123 Ebmatingen, Schweiz  www.jmlab.ch

 

 

A.  ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH

Indirekter Enzymimmunoassay für den Nachweis von Antikörpern gegen Infektionserreger in humanem Serum und Plasma. Der Test ist vorgesehen für die Untersuchung von Einzelproben. In vitro Diagnostikum, darf nur für in vitro diagnostische Zwecke verwendet werden und durch entsprechend geschultes Laborfachpersonal ausgeführt werden.

Der Test kann sowohl manuell als auch in Automaten abgearbeitet werden. Die Bar-Codierung der einzelnen Reagenzien erlaubt ihre eindeutige Identifikation und Zuordnung bei ihrer Anwendung im Rahmen von codierfähigen Systemen.

 

 

B.  PACKUNGSINHALT (für Total 96 Teste)

 

Nr.       BEZEICHNUNG                                                                                          MENGE     VOLUMEN

                Packungsbeilage                                                                                                                             1

                Abklebefolien                                                                                                                                    2

                Beutel mit zusätzlichen Etiketten (je 1), bar kodiert, zur Kennzeichnung von

                zusätzlichen Behältnissen für gebrauchsfertige Lösungen (Nr. 5/6, 7, 8/9, 11)

                Teststreifenaufbewahrungsbeutel                                                                                               1                            

1             Mikrotiterstreifen, antigenbeschichtet (12 x 8 abtrennbare Kavitäten, Tot 96Tests)           2                Beutel

2             Negative Kontrolle, human, gebrauchsfertig (leicht grün)                                                       1                1.5  ml

3             Differentialkontrolle, human, gebrauchsfertig (orange)                                                           1                  3   ml

4             Positive Kontrolle, human, gebrauchsfertig (rot)                                                                       1                1.5  ml

5             Verdünnungspuffer (blau)                                                                                                              2                 20  ml

6             Additiv für Verdünnungspuffer                                                                                                       2                  2   ml

7             Anti-human Ig- G, M, A, MA Konjugatlösung, gebrauchsfertig (blau, gelb, rosa, grün)      1                 12  ml

8/9          TMB Chromogen/Substratlösung gebrauchsfertig                                                                   1                 12  ml

10           Waschlösung Konzentrat                 (25x conc)                                                                           2                 20  ml

11           Stopplösung (Schwefelsäure, max. 0.2 M  korrosiv)                                                                 1                 15  ml

 

C.  ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL

Entionisiertes Wasser. Messzylinder 1000 ml, 500, 250 ml, 100 ml. Pipetten mit einem fixen oder variablen Volumen von 10, 100, 200 und 1000 Mikrolitern, Mehrkanalpipetten mit einem fixen oder variablen Volumen von 100 oder 200 Mikrolitern.

Zusätzliche Fläschchen zur Bereitstellung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung bzw, der Chormogen-Substratlösung

Röhrchen mit geringer Proteinbindung zur Herstellung der Probenvorverdünnungen bspw. aus Polypropylen, Polyethylen oder Glas verwenden.

Inkubator  37 °C +/- 2 °C (Trockeninkubator, bei manueller Abarbeitung sicherstellen, dass die Kavitäten vom Teststreifen mit der Abklebefolie gut abgedeckt wurden, um Verdunstungen zu vermeiden, die zu falsch positiven Ergebnissen führen können).

Waschgerät: Bei manuellen Waschgeräten, Waschzyklen entsprechend den Angaben bei der Testdurchführung einhalten.

Bei automatischen Waschgeräten, Einstellungen entsprechend den Herstellerangaben optimieren, so dass die Validierungskriterien erfüllt werden können. Mikrotiterplattenphotometer: Plattenphotometer mit einem 450 nm Filter. Bei Messungen mit Referenzwellenlängen, wird empfohlen, Filter mit 620 bis 650 nm einzusetzen. Vollautomatische Testabarbeitung mit Hilfe von Automaten mit Bar Code Identifikation möglich.

 

D. LAGERUNG UND HALTBARKEIT

BEZEICHNUNG                                                                                LAGERUNG         HALTBAR                             BEMERKUNGEN

Ungeöffnete Bestandteile der Testpackung                                2...8 °C                  bis Verfallsdatum              

 

Geöffnete Mikrotiterstreifen                                                             2...8 °C                  6 Wochen                             Aufbewahrungsbeutel gut

Verschlossen halten

Geöffnete Komponenten No. 2, 3, 4, 5, 6, 7                                 2...8 °C                  12 Wochen                          Temperaturstress und

Kontamination vermeiden

Gebrauchsfertige Verdünnungslösung (Nr.5+ Nr.6)                 2...8 °C                  12 Wochen                          nur benötigte Menge bereitstellen

                                                                                                              20...25 °C             max. 24 h                             und Kontamination vermeiden

Geöffnete gebrauchsfertige

Substrat/Chromgenlösung (Nr. 8/9)                                             2...8 °C                  12 Wochen                          nur benötigte Menge in einem licht-

                                                                                                                                                                                            dichtem Behältnis bereitstellen.

Waschlösung, gebrauchsfertig                                                      2...8 °C                  12 Wochen                          nur klare Lösung verwenden

                               20...25 °C             max. 2 Wochen                   nur klare Lösung verwenden

Stopplösung                                                                                      20...25 °C             bis Verfallsdatum

 

 

E. TESTDURCHFÜHRUNG

Die Durchführung des Tests ist nur durch entsprechend geschultes Laborfachpersonal vorzunehmen.

Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung Raumtemperatur erreicht haben.

Die Inkubationszeiten betragen: Proben und Kontrollen 30 min. bei 37°C, Konjugat 30 min. bei 37°C und Substrat / Chromogen -Lösung10 bis 20 min. bei Raumtemperatur. Adaptationen an bestimmte, spezielle Arbeitsbedingungen können mit laborinternen Anpassungen der Inkubationszeiten vorgenommen werden.

 

D.1 TESTDURCHFÜHRUNG ÜBERSICHT

 

REAGENZIENVORBEREITUNG / TESTPROTOKOLL ERSTELLEN

 

PROBENARBEITSVERDÜNNUNG:  1/21 Verdünnung

 Bei Mehrfach- Ansätzen entsprechendes Volumen in separatem Röhrchen oder Platten vorsehen:

0.100 ml DER PROBENVERDÜNNUNGEN PIPETTIEREN

 

Bei direkter Probenverdünnung in der Platte wird die Probenverdünnungslösung vorgelegt, und danach die Probe pipettiert:

0.200 ml PROBENVERDÜNNUNGSLÖSUNG + 0.010 ml PATIENTENPROBE pipettiert

 

ZUSÄTZLICH 0.100 ml DER KONTROLLEN PIPETTIEREN

 

INKUBATION DER PROBENVERDÜNNUNGEN UND KONTROLLEN 30 min. bei 37 °C

WASCHEN 4x

 

PIPETTIERUNG DER KONJUGATLÖSUNG (0.100 ml)

 

INKUBATION  MIT KONJUGAT 30 min. bei 37°C

WASCHEN 4x

 

PIPETTIERUNG DER SUBSTRAT / CHROMOGEN – LÖSUNG (0.100 ml)

 

INKUBATION MIT SUBSTRAT / CHROMOGEN - LÖSUNG

(10 bis 20 min  bei Raumtemperatur, ca. 20-25 °C)

 

PIPETTIERUNG DER STOPPLÖSUNG (0.100 ml)

PHOTOMETRISCHE MESSUNG bei 450nm (Ref:630 nm)

 

TESTVALIDIERUNG / AUSWERTUNG

 

F. VALIDIERUNG, KORREKTURHINWEISE

Validierung:

Die erhaltenen Absorptionswerte (Extinktionswerte O.D.-Werte) der Kontrollen werden eingesetzt, wenn die Absorptionswerte der Differentialkontrollen grösser als 0.080  und kleiner als 1.000 sind (optimal zwischen 0.200 und 0.600) und die Abweichungen der jeweiligen Kontrollen innerhalb von +- 20 % von ihrem Mittelwert liegen. Zusätzlich muss der zugehörige Index der negativen Kontrolle < 0.60 und der zugehörige Index der positiven Kontrolle > 1.40 sein. Diese Kriterien gelten für alle unsere Teste.

 

                                                                                              Absorption bei 450nm der Kontrolle

                Indexwert der Kontrollen =               --------------------------------------------------------------------------------   

                                                                              Mittelwert der Absorption bei 450nm der Differentialkontrolle

 

Beispiel einer Validierung: Mittelwert der Differentialkontrolle 1. Wert : O.D.:  0.280, 2. Wert : O.D.:  0.320                 Mittelwert: O.D.: 0.300       

 

                                               Kontrollen                            O.D.- Wert 450 nm                             Index

Absorption (O.D. Wert) der negativen Kontrolle          (Nr. 2)......0.100                   0.100 / 0.300 = 0.333

Absorption (O.D. Wert) der Differentialkontrolle          (Nr. 3) .....0.280                   0.280 / 0.300 = 0.933

Absorption (O.D. Wert) der Differentialkontrolle          (Nr. 3) .....0.320                   0.320 / 0.300 = 1.067

Absorption (O.D. Wert) der positiven Kontrolle            (Nr. 4)......0.600                   0.600 / 0.300 = 2.000

 

Erfüllen die gemessenen OD-Werte die Validierungskriterien, so ist der Test gültig.

Werden diese Kriterien nicht erfüllt, so können die gemessenen OD-Werte einer Korrektur unterworfen werden, bevor eine Testwiederholung vorgenommen wird.

 

Korrekturhiweise:

Sind die Werte zu hoch, so kann eine einfache Korrektur mit einem Faktor (z.B. Faktor 0.5 halbiert die erhaltenen OD-Werte), oder eine gleichmässige Verdünnung und Volumenreduktion der Farblösung aller Proben und Kontrollen vorgenommen werden (z.B. Verdünnung 1 zu 2 halbiert ebenfalls die erhaltenen OD-Werte ), durch diese Korrekturmassnahme  können die erhaltenen OD-Werte ( falls zu hoch)  in den Validierungsbereich gebracht werden. Beim nächsten Lauf wird empfohlen, die Reaktion statt nach 10 bis 20 min., bereits nach 5 bis 10 min. zu stoppen. Sind die O.D.-Werte immer noch zu hoch, so wird empfohlen  beim nächsten Lauf die Konzentration des TMB-Chromogens in der Chromogen/Substratlösung zu halbieren: die konzentrierte Chromogen-Lösung wird 1 zu 41 (0.025 ml Chromogenkonzentrat (No. 9)  zu 1 ml Substratpuffer mit Substrat  (No. 8) hinzugeben) verdünnt statt 1 zu 21 und die Reaktion wird nach 5 und 15 min. gestoppt..

 

Sind die Werte zu tief, so kann mit einer einfachen Multiplikation der erhaltenen Werte mit einem entsprechenden Faktor (2 bis 3) die Werte in den Validierungsbereich gebracht werden. Beim nächsten Lauf wird empfohlen, die Reaktion statt nach 10 min., erst nach  bis 20 min. oder sogar 30 min. zu stoppen.  (Siehe Korrekturhinweise in der detaillierten Gebrauchsanweisung).

 

Lassen sich die Egebnisse nach diesen Korrekturmassnahmen immer noch nicht auswerten, so ist der Test zu wiederholen .

 

G. AUSWERTUNG

Die Auswertung kann erfolgen, wenn die Ergebnisse der Kontrollen die Validierungskriterien erfüllen. Die Auswertung der Ergebnisse für die Proben erfolgt über die Indexbildung für jede einzelne Probe. Der Index wird gebildet aus dem Quotienten der Absorptionswerte (Extinktion, O.D Werte.) der einzelnen Proben und dem Mittelwert der Differentialkontrolle.

 

                                               Absorption bei 450nm der Probe

Index =                  --------------------------------------------------------------------------------    (Index der Proben)

                               Mittelwert der Absorption bei 450nm der Differentialkontrolle

 

Indexwerte (Testreferenzwerte) grösser als 1.00 werden als reaktiv bezeichnet und weisen auf die Anwesenheit von IgG-,    IgM-, und IgA- Antikörpern hin, Testreferenzwerte kleiner als 0.90 werden als nicht reaktiv bezeichnet und weisen auf die Abwesenheit von IgG-, IgM-, und IgA- Antikörpern hin, Testreferenzwerte zwischen 0.90 und 1.00 werden als fraglich eingestuft. Es wird empfohlen, schwach reaktive Ergebnisse bei fraglichen Patientenproben einem Bestätigungstest zu unterziehen oder eine zweite Probe, 10-14 Tage später entnommen, parallel zur ersten Probe zu untersuchen.

 

Beispiel einer qualitativen Auswertung von Probenergebnissen

Bei qualitativer Auswertung werden alle Proben mit höherer Reaktivität als die der Differentialkontrolle als reaktiv bezeichnet, und alle die darunter liegen als nicht reaktiv bezeichnet.

Der Indexbereich kann in Bereiche zunehmender Reaktivität aufgeteilt werden und diesen Bereichen kann eine diagnostische Bedeutung zugeordnet werden. Je höher die Reaktivität, desto höher die diagnostische Bedeutung. 

 

Mittelwert der Differentialkontrolle: 1. Wert : O.D.  0.280,  2. Wert : O.D.  0.320,   Mittelwert: O.D.  0.300

 

Proben O.D. 450 nm          Index/ Testreferenzwert          Index                 Evaluation           

                                                    Bereich                                                          

Probe No. 1........0.080       0.080 / 0.300 = 0.266           < 0.900                nicht reaktiv

Probe No. 2........0.280       0.280 / 0.300 = 0.933         0.900-1.000         Grenzbereich

Probe No. 3........0.350       0.350 / 0.300 = 1.167         1.000-1.500         schwach reaktiv

Probe No. 4........0.500       0.500 / 0.300 = 1.667         1.500-2.000         reaktiv

Probe No. 5........0.700       0.700 / 0.300 = 2.333         2.000-3.000         hoch reaktiv

Probe No. 6........1.000       1.000 / 0.300 = 3.333         3.000-5.000         sehr hoch reaktiv

 

 

Beispiel einer quantitativen Auswertung nach Einführung von relativen Einheiten

Bei Befundangaben erleichtern quantitative Angaben in relativen Einheiten die Beurteilung und Zuordnung der Ergebnisse.

Hierfür kann der Indexwert im einfachsten Fall mit einem Faktor multipliziert und in relativen Einheiten wiedergegeben werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass diesen so errechneten relativen Einheiten  eine logarithmische Skala zu Grunde liegt.

Beispiel hier:  Index-Wert x 10 ergibt die relativen Einheiten:

Ergebnisse O.D.- Wert, Indexwerte und relative Einheiten:

                               Probe No.1           Probe No.2           Probe No.3           Probe No.4           Probe No.5           Probe No.6          

O.D. Wert:             0.080                     0.280                     0.350                     0.500                     0.700                     1.000

Index Wert:           0.266                     0.933                     1.167                     1.667                     2.333                     3.333

Rel. Einheiten:     2.66                       9.33                       11.67                     16.67                     23.33                     33.33

 

Weitere Auswertemethoden wie z.B. die Quantifizierung mit Hilfe einer Standardkurve oder mit Hilfe der <Ein Punkt  Quantifizierung> sind möglich.

Alle diese zusätzlichen Auswertemethoden haben aber als gemeinsame Grundoperation eine Verhältnisbildung der Grundreaktivität mit mindestens einem Standard bevor weitere mathematische Transformationen (logarithmisch, exponentiell, polynomial, 4 PL Modell etc.) vorgenommen werden, um die entsprechenden relativen Einheiten auszurechnen.

Die Skala der so erhaltenen relativen Einheiten werden ebenfalls in Bereiche zusammengefasst, die mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit einer diagnostischen Bedeutung zugeordnet werden können.

Grundsätzlich haben alle diese Auswertemethoden aber die gleichen gemessenen Ausgangsbezugswerte (Absorptions- werte, Extinktionswerte, OD-Werte) und entsprechende Reaktivitäts-Unterscheidungsbereiche.

 

H. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Die Wahrscheinlichkeit, erhaltene Reaktivitäten einer diagnostischen Bedeutung zuordnen zu können, nimmt zu mit zunehmendem Absorptionswert, beziehungsweise zunehmendem Indexwert oder Wert der relativen Einheiten.

Beispiel:

Proben     O.D. 450 nm    Index      Index Bereich       Relative Einheiten Bereich               Evaluation               Diagnostische

                               (z.B.: Index x 10)   Rel. Einheiten                                       Bedeutung

Probe No. 1........0.080       0.266          < 0.900                   2.66                      < 9                    nicht reaktiv                - - -

Probe No. 2........0.280       0.933      0.900-1.000              9.33                     9 –10                Grenzbereich             - - / +

Probe No. 3........0.350       1.167      1.000-1.500             11.67                   10 –15               schwach reaktiv       - / + +

Probe No. 4........0.500       1.667     1.500-2.000             16.67                   15 –20               reaktiv                          + + +

Probe No. 5........0.700       2.333     2.000-3.000             23.33                   20 –30               hoch reaktiv                + + + +

Probe No. 6........1.000       3.333           >3.000                  33.33                     >30                  sehr hoch reaktiv     + + + + +

 

Im Allgemeinen weist die Anwesenheit von IgG-Antikörpern auf eine zurückliegende Infektion oder Impfung hin. Der Nachweis von IgG Antikörpern  beim Verlauf einer Infektion kann auf eine akute Infektion hinweisen, wenn die Ergebnisse einer parallelen Bestimmung zweier Proben, im Abstand von 10-14 Tagen entnommen, auf eine  Serokonversion (Konversion von negativ zu positiv) hinweisen. Es ist zu berücksichtigen, dass in der frühen Phase einer Serokonversion, die erhaltenen Werte noch unterhalb der Werte der Differentialkontrolle liegen können.

 

Es wird empfohlen grenzwertige und schwach reaktive Proben nachzutesten zusammen mit einer zusätzlichen Probe, 10 bis 14 Tage später entnommen, um Reaktivitätsunterschiede zu erfassen, die auf eine laufende Infektion hinweisen. Werden keine Reaktivitätsunterschiede festgestellt, so kann eine entsprechende Infektion ausgeschlossen werden.

Der gleichzeitige Nachweis von IgM-Antikörpern und IgA-Antikörpern bei einer Serokonversion im IgG-Bereich erhärtet einen positiven Befund.

 

Der Nachweis von IgM- und IgA-Antikörpern  während des Verlaufs einer Infektion weist auf eine akute Infektion hin.

Es ist zu berücksichtigen, dass in der frühen Phase einer Serokonversion, die erhaltenen Werte noch unterhalb der Werte der Differentialkontrolle liegen können, sodass die Bestimmung von IgM und IgA-Antikörpern in einer zweiten Probe, 10-14 Tage später entnommen, in einem parallelen Ansatz mit der ersten Probe, eine sicherere diagnostische Aussage ermöglicht, wenn die Resultate auf eine Serokonversion bzw. auf deutliche Reaktivitätsunterschiede hinweisen.

Es wird empfohlen grenzwertige und schwach reaktive Proben nachzutesten, zusammen mit einer zusätzlichen Probe, 10 bis 14 Tage später entnommen, um Reaktivitätsunterschiede zu erfassen, die auf eine laufende Infektion hinweisen. Werden keine Reaktivitätsunterschiede festgestellt, so kann eine entsprechende Infektion ausgeschlossen werden.

Positive Ergebnisse, mit sehr hoher IgM- und IgA-Reaktivität, weisen mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine akute Infektion hin. Der gleichzeitige Nachweis einer Serokonversion im IgG Bereich erhärtet einen positiven Befund.

 

Jeder serologische Befund sollte immer zusammen mit den klinischen Daten interpretiert werden.

 

Die Anwesenheit von Interferenzfaktoren in einer Probe, wie bspw. Rheuma-Faktor (RF), kann zu falsch positiven IgM/IgA-Ergebnissen führen, eine Überprüfung auf Rheuma-Faktor und eine Vorbehandlung der Testprobe vor dem Testlauf mit einem RF-Absorbens wird empfohlen.

(RF-Absorbens ist auch von uns erhältlich und kann unter REF RFA-192 (10 ml, 100 Ansätze) bestellt werden).

 

 

Literature recommended for further reading:

American Public Health Association Bookstore

Clinical Microbiology Procedures Handbook

Communicable Disease Control and Laboratory Procedures